Νέα & Ανακοινώσεις

Discovery of SARS-CoV‑2 Papain-like Protease Inhibitors through a Combination of High-Throughput Screening and a FlipGFP-Based Reporter Assay

Discovery of SARS-CoV‑2 Papain-like Protease Inhibitors through a Combination of High-Throughput Screening and a FlipGFP-Based Reporter Assay
csm akolokouris 12af0eee8e

του Αντώνιου Κολοκούρη, Καθηγητή του Τομέα Φαρμακευτικής Χημείας του Τμήματος Φαρμακευτικής του ΕΚΠΑ

Short summary: The papain-like protease (PLpro) of SARS-CoV-2 is a validated antiviral drug target. In a recent study Dr Jun Wang (University of Arizona) in collaboration with Prof Kolocouris (Dept of Pharmacy, NKUA)  1 (a) identified new non-covalent inhibitors of PLpro and investigated with X-ray crystallography and MD simulations the way they interacted with this enzyme (b) invented a cell-based FlipGFP reporter assay was developed for the screening of SARS-CoV-2 papain-like protease inhibitors and was shown to have a positive correlation with antiviral activity (published in ACS Cent. Sci. 2021, 7, 7, 1245–1260, IF = 15).

Extended Summary: Given the tremendous impact of the COVID-19 pandemic, the SARS-CoV outbreak in 2003 was a dire warning that was gravely overlooked in retrospect. It is imperative that therapeutics are developed that are not only effective against SARS-CoV-2 but against future strains of similar coronaviruses. The papain-like protease (PLpro) of SARS-CoV-2 is a validated and high-profile drug target, partially because it is highly conserved between SARS-CoV and SARS-CoV-2, sharing 83% sequence similarity. PLpro is involved in the cleavage of viral polyproteins and antagonizing host innate immune response through its deubiquitinating and deISG15ylating activities, rendering it a high profile antiviral drug target.

The majority of the cysteine protease inhibitors are covalent inhibitors targeting the catalytic cysteine,2 and it remains a challenge to develop noncovalent cysteine protease inhibitors with a similar potency as the covalent inhibitors.

Previous attempts to discover noncovalent SARS-CoV-2 PLpro inhibitors through High-Throughput Screening (HTS) have failed to identify hits with improved enzymatic inhibition and cellular antiviral activity. 3 Through a FRET-based high-throughput screening, several hits were identified, eg. GRL0617 4 (EC50 = 25.1 µM) (Fig. 1) as PLpro inhibitors with IC50 values at the double or single-digit micromolar range. Inhibitors like GRL0617 are equally effective against both viruses, with a Ki of 0.49 μM and 0.57 μM, against SARS-CoV PLpro and SARS-CoV-2 PLpro4 Likewise, all critical active site residues that interact with GRL0617 are conserved. These similarities would indicate that PLpro inhibitors might retain their activity against beta coronaviruses that might emerge in the future. While among the reported SARS-CoV or SARS-CoV-2 PLpro inhibitors, GRL0617 is one of the most potent compounds, it had weak antiviral activity (Vero E6: EC50 = 23.64 μM; Caco2-hACE2: EC50 = 19.96 μM). Structural analogues of GRL0617 were also designed and synthesized; however, none showed improved enzymatic inhibition. 5 

In this study we solved the X-ray crystal structure of the wild-type SARS-CoV-2 PLpro in complex with GRL0617 (Fig. 1). Binding of GRL0617 to SARS-CoV-2 induced a conformational change in the BL2 loop to the more closed conformation. Part of the reason for the difficulty in targeting SARS-CoV-2 PLpro is the lack of S1 and S2 pockets (Fig. 1), which leaves only S3 and S4 pockets for inhibitor binding. The intrinsic flexibility of the BL2 loop implies that structurally diverse inhibitors might be able to fit in the S3–S4 pockets.

We aimed to identify more potent SARS-CoV-2 PLpro inhibitors through a HTS. To prioritize lead compounds for the cellular antiviral assay against SARS-CoV-2, we developed a cell-based fluorescence resonance energy transfer (FlipGFP assay) that is suitable for quantifying the intracellular enzymatic inhibition potency of PLpro inhibitors. The advantage of the FlipGFP-PLpro assay over the standard FRET-based enzymatic assay is that it can rule out compounds that are either cytotoxic or membrane impermeable or nonspecifically modifying the catalytic cysteine through oxidation or alkylation.

Through this FlipGFP-PLpro assay high-throughput screening two compounds selected from the FlipGFP-PLpro assay, Jun9-53-2 and Jun9-72-2, inhibited SARS-CoV-2 replication in Caco-2 hACE2 cells with EC50 values of 8.89 and 8.32 µM, respectively, which were 3-fold more potent than GRL0617 (EC50 = 25.1 µM). The X-ray crystal structures of PLpro in complex with GRL0617 showed that binding of GRL0617 to SARS-CoV-2 induced a conformational change in the BL2 loop to the more closed conformation (Fig. 1). After subsequent lead optimization, we identified several PLpro inhibitors including Jun9-72-2 and Jun9-75-4 with improved enzymatic inhibition and antiviral activity compared to GRL0617, which was reported as a SARS-CoV PLpro inhibitor.

In total, three PLpro inhibitors Jun9-72-2Jun9-85-1, and Jun9-87-1 were identified as potent SARS-CoV-2 antivirals with EC50 values at or less than 10 μM when tested in both the Vero E6 and Caco2-hACE2 cell lines (Fig. 2). As shown by the MD simulations (Fig. 3), the replacement of the carboxamide group in GRL0617 to the trialkyl ammonium in Jun9-53-2Jun9-72-2, and Jun9-75-4 affects the binding interactions inside the receptor-binding region. In comparison to GRL0617, the N–H+ group in Jun9-53-2Jun9-72-2, and Jun9-75-4 is engaged in strong ionic hydrogen bonding interactions with a side chain of Asp164, participating in another stabilizing ionic hydrogen bonding interactions with Arg166, which pulls the ligands inside the receptor-binding region from the hydrogen-bonded Gln269 to a new T-shaped π–π stacking with the Ty264 instead of Tyr268 in GRL0617. All the four ligands form hydrophobic interactions between naphthalene ring and Pro248. In conclusion, the SARS-CoV-2 PLpro inhibitors discovered in this study represent promising hits for further development as SARS-CoV-2 antivirals, the FlipGFP-PLpro assay is a suitable surrogate for testing the cellular activity of PLpro inhibitors in the BSL-2 setting, and the results can be used to help prioritize leads for the antiviral assay. This is expected to speed up the drug discovery process.

Εικόνα1
GRL0617
Εικόνα2
Fig 1. Complex structure of SARS-CoV-2 PLpro with GRL0617. The protein and ligand of the SARS-CoV-2 complex are colored in light green and dark green, respectively. C111* indicates the catalytic cysteine. (A) Binding mode of GRL0617 , shown in gray. Hydrogen bonds are shown as red dashed lines. (B) Superimposition with apo SARS-CoV-2 PLpro (salmon, PDB ID 6WZU). Significant rearrangement is observed in the loop comprising residues Asn267-Cys270 upon GRL0617 binding. These movements are indicated with arrows. (C) Superimposition with the terminal five residues of the ubiquitin-like protein ISG15 substrate (orange) from the complex with SARS-COV-2 PLpro (PDB ID 6XA9, showing only the ligand). The atoms of the Leu side chain at the P4 position are labeled. (D) Superimposition with the catalytic mutant C/S111 in complex with GRL0617 (PDB ID 7JIR, light blue and dark blue).
Χωρίς τίτλο
Fig. 2 SAR of SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. (A)Analogs of GRL0617 purchased from Enamine. (B)Synthetic compounds designed based on the SAR results. Potent compounds with IC50 values less than 1 µM were highlighted in red.
Εικόνα3
Figure 3. Molecular dynamics simulations of SARS-CoV-2 PLpro with GRL0617Jun9-53-2Jun9-72-2, and Jun9-75-4. In (A), (D), (G), and (J) are shown representative frames from 100 ns MD simulations of the complexes between the GRL0617Jun9-53-2Jun9-72-2, and Jun9-75-4 inside SARS-CoV-2 PLPro (protein = light blue ribbon and sticks; the ligand’s carbons are shown in green; nitrogen and oxygen are shown in blue and red, respectively; hydrogen bonding interactions are shown with red dashes). In (B), (E), (H), and (K) are shown stabilizing interactions inside the binding area of PLpro with inhibitors; hydrogen bonding interactions are depicted in blue, π–π stacking in yellow, hydrophobic interactions in brown, and water bridges in green. The binding interactions are considered important when the frequency bar is ≥0.2. In (C), (F), (I), and (L) are shown the RMSD plots of Cα carbons of the protein (blue diagram) and of the ligand (red diagram).

References

(1) Ma, C.; Sacco, M. D.; Xia, Z.; Lambrinidis, G.; Townsend, J. A.; Hu, Y.; Meng, X.; Szeto, T.; Ba, M.; Zhang, X.; et al. Discovery of SARS-CoV-2 Papain-like Protease Inhibitors through a Combination of High-Throughput Screening and a FlipGFP-Based Reporter Assay. ACS Cent. Sci. 2021, 7 (7), 1245–1260. https://doi.org/10.1021/acscentsci.1c00519.

(2) Siklos, M.; BenAissa, M.; Thatcher, G. R. J. Cysteine Proteases as Therapeutic Targets: Does Selectivity Matter? A Systematic Review of Calpain and Cathepsin Inhibitors. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2015. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2015.08.001.

(3) Fu, Z.; Huang, B.; Tang, J.; Liu, S.; Liu, M.; Ye, Y.; Liu, Z.; Xiong, Y.; Zhu, W.; Cao, D.; et al. The Complex Structure of GRL0617 and SARS-CoV-2 PLpro Reveals a Hot Spot for Antiviral Drug Discovery. Nat. Commun. 2021. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20718-8.

(4) Ratia, K.; Pegan, S.; Takayama, J.; Sleeman, K.; Coughlin, M.; Baliji, S.; Chaudhuri, R.; Fu, W.; Prabhakar, B. S.; Johnson, M. E.; et al. A Noncovalent Class of Papain-like Protease/Deubiquitinase Inhibitors Blocks SARS Virus Replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. https://doi.org/10.1073/pnas.0805240105.

(5) Osipiuk, J.; Azizi, S.-A.; Dvorkin, S.; Endres, M.; Jedrzejczak, R.; Jones, K. A.; Kang, S.; Kathayat, R. S.; Kim, Y.; Lisnyak, V. G.; et al. Structure of Papain-like Protease from SARS-CoV-2 and Its Complexes with Non-Covalent Inhibitors. Nat. Commun. 2021, 12 (1), 743. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21060-3.

Μια πρωτότυπη μέθοδος προσέγγισης μονοκόρυφα εξελισσόμενων δεδομένων και η  εφαρμογή της σε μια έξαρση Covid-19

Μια πρωτότυπη μέθοδος προσέγγισης μονοκόρυφα εξελισσόμενων δεδομένων και η εφαρμογή της σε μια έξαρση Covid-19

Ο καθηγητής Ιωάννης Κ. Δημητρίου δημοσίευσε μια μελέτη στο έγκριτο περιοδικό Optimization Methods & Software με τίτλο “Least Squares Monotonic Unimodal Approximations to Successively Updated Data and an Application to a Covid-19 Outbreak”. Η μελέτη αναπτύσσει έναν αλγόριθμο προσέγγισης δεδομένων εν εξελίξει, αλλοιωμένων από σφάλματα, ώστε να εκτιμήσει το σημείο στροφής (ακρότατο) μιας έξαρσης (outbreak). […]

Ρεπορτάζ του τηλεοπτικού σταθμού Alpha για την ανακαίνιση χώρων της Νομικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών

Ρεπορτάζ του τηλεοπτικού σταθμού Alpha για την ανακαίνιση χώρων της Νομικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών

Όπως ανέφερε χαρακτηριστικά το ρεπορτάζ του τηλεοπτικού σταθμού Alpha: «Χώροι της Νομικής Σχολής που βρισκόταν για χρόνια υπό κατάληψη και παρουσίαζαν εικόνα εγκατάλειψης, αποκαταστάθηκαν, ανακαινίστηκαν και παραδόθηκαν στους φοιτητές και στους καθηγητές του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Τους χώρους αυτούς επισκέφθηκε η υπουργός Παιδείας Σοφία Ζαχαράκη, μετά τη συνάντηση εργασίας που είχε με τον […]

Διϊδρυματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Θεωρητική και Εφαρμοσμένη Γεωπολιτική Ανάλυση στις Διεθνείς Σχέσεις και τη Στρατηγική»

Διϊδρυματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Θεωρητική και Εφαρμοσμένη Γεωπολιτική Ανάλυση στις Διεθνείς Σχέσεις και τη Στρατηγική»

Το Τμήμα Τουρκικών Σπουδών και Σύγχρονων Ασιατικών Σπουδών της Σχολής Οικονομικών και Πολιτικών Επιστημών του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, σε συνεργασία με τη Σχολή Αγρονόμων και Τοπογράφων Μηχανικών – Μηχανικών Γεωπληροφορικής του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου, διοργανώνουν το νέο Διϊδριματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών (Δ.Π.Μ.Σ.) «Θεωρητική και Εφαρμοσμένη Γεωπολιτική Ανάλυση στις Διεθνείς Σχέσεις και τη Στρατηγική». […]

Επιστημονική εκδήλωση για την Ενδοσχολική Βία και τον Εκφοβισμό (Ε.ΒΙ.Ε.)

Επιστημονική εκδήλωση για την Ενδοσχολική Βία και τον Εκφοβισμό (Ε.ΒΙ.Ε.)

Με ιδιαίτερη επιτυχία πραγματοποιήθηκε την Τετάρτη 18 Ιουνίου 2025, στην αίθουσα εκδηλώσεων της Νομικής Βιβλιοθήκης, η επιστημονική εκδήλωση με τίτλο: «Ενδοσχολική βία και εκφοβισμός: Ψυχοκοινωνικές και νομικές διαστάσεις – Προεκτάσεις και κριτικός αναστοχασμός». Η εκδήλωση συνδιοργανώθηκε από το Εργαστήριο Κοινωνικής και Οργανωσιακής Ψυχολογίας του Παιδαγωγικού Τμήματος Δημοτικής Εκπαίδευσης του ΕΚΠΑ και το Εργαστήριο Ποινικών και […]

Μνημόνιο Συνεργασίας μεταξύ του Πανεπιστημίου Αθηνών και του Πανεπιστημίου Georgetown

Μνημόνιο Συνεργασίας μεταξύ του Πανεπιστημίου Αθηνών και του Πανεπιστημίου Georgetown

Μνημόνιο Συνεργασίας μεταξύ του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών και του Πανεπιστημίου Georgetown υπογράφηκε τη Δευτέρα 7 Ιουλίου 2025 στο Κεντρικό Κτήριο του Πανεπιστημίου Αθηνών. Το Μνημόνιο υπέγραψαν ο Πρύτανης καθηγητής Γεράσιμος Σιάσος, από την πλευρά του ΕΚΠΑ, και ο Κοσμήτορας του Earth Commons Institute Καθηγητής Peter Marra, από την πλευρά του Georgetown University. Στην […]

Παρουσίαση του Πλαισίου Ταξινόμησης Πόρων των Ηνωμένων Εθνών (UNFC) και του Διεθνούς Προτύπου Αναφοράς CRIRSCO

Παρουσίαση του Πλαισίου Ταξινόμησης Πόρων των Ηνωμένων Εθνών (UNFC) και του Διεθνούς Προτύπου Αναφοράς CRIRSCO

Με επιτυχία πραγματοποιήθηκε τη Δευτέρα 30 Ιουνίου 2025, στο Τμήμα Γεωλογίας και Γεωπεριβάλλοντος του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, ενημερωτική παρουσίαση με αντικείμενο τη συγκριτική ανάλυση μεταξύ του Πλαισίου Ταξινόμησης Πόρων των Ηνωμένων Εθνών (UNFC) και του Διεθνούς Προτύπου Αναφοράς CRIRSCO. Η παρουσίαση έγινε από τον κ. Χαράλαμπο Βασιλάτο, Αναπληρωτή Καθηγητή Κοιτασματολογίας του Ε.Κ.Π.Α. και […]

Συμμετοχή σε Διεθνές Επιστημονικό Συνέδριο του Τμήματος Διαχείρισης Λιμένων και Ναυτιλίας του ΕΚΠΑ    – WCTRS, University of Antwerp 

Συμμετοχή σε Διεθνές Επιστημονικό Συνέδριο του Τμήματος Διαχείρισης Λιμένων και Ναυτιλίας του ΕΚΠΑ    – WCTRS, University of Antwerp 

Το Τμήμα Διαχείρισης Λιμένων και Ναυτιλίας, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, συμμετείχε δυναμικά στο Διεθνές Επιστημονικό Συνέδριο ‘International SIGA2 Conference 2025’ που πραγματοποιήθηκε πρόσφατα (7-9.5.2025) στο University of Antwerp, Βέλγιο, με εστίαση στο ‘Academic Excellence Meets Global Dialogue on Strategic Maritime Affairs’. Το Διεθνές Συνέδριο διοργανώθηκε από το Special Interest Group A2: Ports and […]

Διϊδρυματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Θεωρητική και Εφαρμοσμένη Γεωπολιτική Ανάλυση στις Διεθνείς Σχέσεις και τη Στρατηγική»

Διϊδρυματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Θεωρητική και Εφαρμοσμένη Γεωπολιτική Ανάλυση στις Διεθνείς Σχέσεις και τη Στρατηγική»

Το Τμήμα Τουρκικών Σπουδών και Σύγχρονων Ασιατικών Σπουδών της Σχολής Οικονομικών και Πολιτικών Επιστημών του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, σε συνεργασία με τη Σχολή Αγρονόμων και Τοπογράφων Μηχανικών – Μηχανικών Γεωπληροφορικής του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου, διοργανώνουν το νέο Διϊδριματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών (Δ.Π.Μ.Σ.) «Θεωρητική και Εφαρμοσμένη Γεωπολιτική Ανάλυση στις Διεθνείς Σχέσεις και τη Στρατηγική». […]

Επιστημονική εκδήλωση για την Ενδοσχολική Βία και τον Εκφοβισμό (Ε.ΒΙ.Ε.)

Επιστημονική εκδήλωση για την Ενδοσχολική Βία και τον Εκφοβισμό (Ε.ΒΙ.Ε.)

Με ιδιαίτερη επιτυχία πραγματοποιήθηκε την Τετάρτη 18 Ιουνίου 2025, στην αίθουσα εκδηλώσεων της Νομικής Βιβλιοθήκης, η επιστημονική εκδήλωση με τίτλο: «Ενδοσχολική βία και εκφοβισμός: Ψυχοκοινωνικές και νομικές διαστάσεις – Προεκτάσεις και κριτικός αναστοχασμός». Η εκδήλωση συνδιοργανώθηκε από το Εργαστήριο Κοινωνικής και Οργανωσιακής Ψυχολογίας του Παιδαγωγικού Τμήματος Δημοτικής Εκπαίδευσης του ΕΚΠΑ και το Εργαστήριο Ποινικών και […]

Μνημόνιο Συνεργασίας μεταξύ του Πανεπιστημίου Αθηνών και του Πανεπιστημίου Georgetown

Μνημόνιο Συνεργασίας μεταξύ του Πανεπιστημίου Αθηνών και του Πανεπιστημίου Georgetown

Μνημόνιο Συνεργασίας μεταξύ του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών και του Πανεπιστημίου Georgetown υπογράφηκε τη Δευτέρα 7 Ιουλίου 2025 στο Κεντρικό Κτήριο του Πανεπιστημίου Αθηνών. Το Μνημόνιο υπέγραψαν ο Πρύτανης καθηγητής Γεράσιμος Σιάσος, από την πλευρά του ΕΚΠΑ, και ο Κοσμήτορας του Earth Commons Institute Καθηγητής Peter Marra, από την πλευρά του Georgetown University. Στην […]

Παρουσίαση του Πλαισίου Ταξινόμησης Πόρων των Ηνωμένων Εθνών (UNFC) και του Διεθνούς Προτύπου Αναφοράς CRIRSCO

Παρουσίαση του Πλαισίου Ταξινόμησης Πόρων των Ηνωμένων Εθνών (UNFC) και του Διεθνούς Προτύπου Αναφοράς CRIRSCO

Με επιτυχία πραγματοποιήθηκε τη Δευτέρα 30 Ιουνίου 2025, στο Τμήμα Γεωλογίας και Γεωπεριβάλλοντος του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, ενημερωτική παρουσίαση με αντικείμενο τη συγκριτική ανάλυση μεταξύ του Πλαισίου Ταξινόμησης Πόρων των Ηνωμένων Εθνών (UNFC) και του Διεθνούς Προτύπου Αναφοράς CRIRSCO. Η παρουσίαση έγινε από τον κ. Χαράλαμπο Βασιλάτο, Αναπληρωτή Καθηγητή Κοιτασματολογίας του Ε.Κ.Π.Α. και […]

Συμμετοχή σε Διεθνές Επιστημονικό Συνέδριο του Τμήματος Διαχείρισης Λιμένων και Ναυτιλίας του ΕΚΠΑ    – WCTRS, University of Antwerp 

Συμμετοχή σε Διεθνές Επιστημονικό Συνέδριο του Τμήματος Διαχείρισης Λιμένων και Ναυτιλίας του ΕΚΠΑ    – WCTRS, University of Antwerp 

Το Τμήμα Διαχείρισης Λιμένων και Ναυτιλίας, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, συμμετείχε δυναμικά στο Διεθνές Επιστημονικό Συνέδριο ‘International SIGA2 Conference 2025’ που πραγματοποιήθηκε πρόσφατα (7-9.5.2025) στο University of Antwerp, Βέλγιο, με εστίαση στο ‘Academic Excellence Meets Global Dialogue on Strategic Maritime Affairs’. Το Διεθνές Συνέδριο διοργανώθηκε από το Special Interest Group A2: Ports and […]

Το Πανεπιστήμιο Αθηνών

Το Ε.Κ.Π.Α. το οποίο εγκαινιάστηκε στις 3 Μαΐου του 1837, αρχικά στεγάστηκε σε ένα ανακαινισμένο οθωμανικό κτήριο στη βορειοανατολική πλευρά της Ακρόπολης, το οποίο στις μέρες μας έχει ανακαινιστεί και λειτουργεί ως Μουσείο του Πανεπιστημίου. Αρχικά ονομάστηκε «Οθωνικό Πανεπιστήμιο» από το όνομα του πρώτου βασιλιά της Ελλάδας Όθωνα και αποτελούνταν από 4 ακαδημαϊκά Τμήματα με 52 φοιτητές. Καθώς αποτελούσε το πρώτο Πανεπιστήμιο του νεοσύστατου ελληνικού κράτους, αλλά και της ευρύτερης βαλκανικής και μεσογειακής περιοχής, απέκτησε σημαντικό κοινωνικο-ιστορικό ρόλο, ο οποίος υπήρξε καθοριστικός για την παραγωγή συγκεκριμένης γνώσης και πολιτισμού μέσα στη χώρα.

Stay Connected

Ακολουθήστε το hub.uoa.gr στα Social Media

Newsletter

Γραφτείτε για να λαμβάνετε ενημερώσεις

closebutton
Μετάβαση στο περιεχόμενο